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豬瘟單克隆抗體ELISA實驗

日期:2013-11-20瀏覽:1268次

1.豬瘟單抗純化抗原
2.兔抗豬IgG酶標抗體
3.豬瘟陽性血清
4.豬瘟陰性血清
1~4均由的生物制品所購買。
5.elisa反應板
6.包被液
碳酸鈉 1.50g
碳酸氫鈉 2.93g
H2O加至 1 000ml
pH值9.6
7.PBS液
氯化鈉 8.90g
磷酸二氫鉀 0.20g
無水磷酸氫二鈉 2.13g
加雙餾水 1 000ml
8.PBS-吐溫洗滌液
PBS液 1 000ml
犢牛血清 5ml
混合即可
9.底物溶液
⑴ 0.1Mol/L檸檬酸液
檸檬酸 21g
雙蒸餾水加至 1 000ml
⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.6g
雙蒸餾水 加至 1 000ml
⑶ pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液
取⑴液 24.30ml
⑵液 25.70ml
混勻即可
⑷鄰苯二胺液
取⑶液 50ml
雙餾水 50ml
磷苯二胺 20mg
30%H2O2 0.15ml
待鄰苯二胺溶化后再加H2O2,現用現配。
10.終止液
濃H2SO4(98%) 22.2ml
H2O 177.80ml
(二)操作方法
1.用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯抗原各做100倍稀釋,每孔包被100µl,4℃濕盒過整夜。
2.次日取出,甩去孔內液體,3×3′沖洗。
3.將待檢血清以PBS液做400倍稀釋,每孔加100µl同時將豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清各做100倍稀釋,于對照孔中加100μl。37℃溫育1.5h~2h。
4.重復第二步,取出,甩去孔內液體,3×3′洗滌。
5.將兔抗豬IgG酶標抗體以PBS液做100倍稀釋,每孔加100μl,37℃溫育1.5h~2h。
6.重復第4步。
7.每孔加底物溶液100µl,室溫下觀察顯色反應。當陰性對照孔稍顯色時,立即終止反應,并以陰性孔做空白對照。
8.每孔加終止液50µl立即于酶聯免疫吸附檢測儀測定490nm波長的光密度。
(三)結果判定
在豬瘟弱毒酶聯板上,OD≥0.2,為豬瘟弱毒抗體陽性;OD<0.2,為豬瘟弱毒抗體陰性。

在豬瘟強毒酶聯板上,OD≥0.5,為豬瘟強毒抗體陽性;OD<0.2,為豬瘟強毒抗體陰性。
 

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