一、目的
    (Fab')2-ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中zui靈敏的檢測(cè)方法之一，配合背景反應(yīng)很淺的堿性磷酸酯酶檢測(cè)下限可以達(dá)到納克水平，對(duì)于少量樣品或含量低的病毒檢測(cè)效果好。它利用蛋白酶去掉抗體IgG中的Fc片段，使雙抗體夾心的優(yōu)點(diǎn)只使用一種抗體就可以實(shí)現(xiàn)。
二、實(shí)驗(yàn)材料和用具
    1.專化性抗體免疫球蛋白IgG(濃度約為1mg/ml)。
    2.系統(tǒng)感染病毒的植株和健康植株。
    3.酶標(biāo)記羊抗兔抗體球蛋白IgG(市售)或A蛋白標(biāo)記的堿性磷酸酯酶(Sigma產(chǎn)品)。
    4.酶聯(lián)板、微量加樣器、洗瓶、酶聯(lián)讀數(shù)儀。
    5.抗原包被緩沖液、洗滌緩沖液、IgG稀釋緩沖液、底物溶液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
    1.配制緩沖液 
      ① 抗原包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6) 
         Na2C031.59g；NaHCO32.93g；NaN30.2g蒸餾水加至1升。
      ② 洗滌緩沖液(0.02MPBS-吐溫緩沖液，PBS-T，pH7.4) 
         NaCl8.0g ；Na2HPO4 '12H2O2.9g；KH2PO4 0.2g； 
         KCl0.2g；NaN30.2g；蒸餾水加至1升后加Tween-200.5ml.
      ③ IgG稀釋緩沖液(0.02MPBS-T，牛血清白蛋白溶液) 
         取0.1g牛血清白蛋白溶于用滅菌蒸餾水配制的PBS-T緩沖液100ml中即成。 
      ④ 底物溶液(鄰苯二胺溶液) 
         a液：檸檬酸19.2克加水溶至1000ml為0.1M檸檬酸溶液 
         b液：Na2HPO4.12H2O71.6g加水溶至1000ml為0.2MNa2HPO4溶液。 
         取a液24.3ml加b液25.7ml混合即成磷酸鹽-檸檬酸緩沖液pH5.0 。 
         稱取40mg鄰苯二胺，溶解后過(guò)濾，加上述緩沖液至100ml，臨用前加30%H2O2 0.15ml即成。
      ⑤ 堿性磷酸脂酶底物緩沖液： 
         二乙醇胺緩沖液：二乙醇胺97ml，蒸餾水800ml，混合，用濃HCl調(diào)pH=9.8，加水至1000ml。取硝基酚磷酸pNPP60mg溶于100ml上述二乙醇胺緩沖液中，即為底物緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用，時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)變色)。 
         堿性磷酸脂酶標(biāo)記的A蛋白，溶于1.0ml50%甘油中即可使用。 
    2.取顯癥葉片和健康葉片用抗原包被緩沖液分別配制1:10，1:100，1:1000樣品懸浮液，過(guò)濾或低速離心后備用。 
    3.按設(shè)計(jì)(同實(shí)驗(yàn)三)在酶聯(lián)板上加樣，每孔200μl，(Fab')2以1/2000-4000的比例稀釋在50mM包被緩沖液(pH9.6)中；在30℃下孵育四小時(shí)，或4℃放置一個(gè)晚上(時(shí)間長(zhǎng)，包被好)； 
    4.洗板三次同實(shí)驗(yàn)三； 
    5.樣品稀釋在提取緩沖液中，4℃下孵育放置一個(gè)晚上；洗板同前； 
    6.IgG(可用未純化的抗血清)以1/2000-4000的比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時(shí)，洗板同前； 
    7.酶標(biāo)A蛋白以1/2500比例稀釋在提取緩沖液中，30℃孵育三小時(shí)，洗板同前； 
    8.加底物，室溫孵育不超過(guò)30分鐘(過(guò)氧化物酶)，2-4小時(shí)(堿性磷酸酯酶)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定結(jié)果。
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